Der Spieler schlüpft in „Assassin's Creed 2“ in die Rolle des jungen Adligen Ezio Auditore de Firenze, dessen Familie wegen betrügerischer Machenschaften rivalisierender Clans unterging. Ezio ist somit ein Nachkomme Altairs, dem Protagonisten des erfolgreichen Vorgängers. Im Gegensatz zu Altair hat Ezio viele neue Fähigkeiten – er kann sogar schwimmen.Im ersten Teil wurde der Spieler als mysteriöser Auftragsmörder Altair in die Welt der Kreuzzüge im 12. Jahrhundert versetzt – im zweiten Teil wird das Geschehen vom Mittelalter in die Renaissance verlegt. In „Assassin's Creed 2“ sind die Städte nicht länger isolierte Orte, denn es gibt mehr Missionen, die die Städte miteinander verbinden. Während Ezio sich durch das mittelalterliche Florenz bewegt, begegnet er historischen Persönlichkeiten wie Niccoló Machiavelli oder Vertretern des mächtigen Medici-Clans.Mit einigen neuen Fähigkeiten und Kampftechniken wird es Ezio möglich sein, seine Gegner von Häuserdächern zu schleudern oder versteckt aus einem Heuballen heraus anzugreifen. Zudem wird es eine Reihe von neuen Waffen geben und dieses Mal wird der Spieler auch seine Gegner entwaffnen und deren Waffe nutzen können.